Clostridium acetobutylicum ist ein lösungsmittelbildendes Bakterium, welches in der exponentiellen Wachstumsphase zunächst die Säuren Acetat und Butyrat bildet, wodurch der pH-Wert absinkt. Beim Übergang in die stationäre Phase kommt es zur Veränderung des Stoffwechsels und die Bildung der Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol setzt sein. Vor allem das produzierte Butanol macht den Organismus industriell interessant, da es als „Biokraftstoff“ nutzbar ist. Unter diesem Aspekt war das Ziel in dieser Arbeit die Steigerung der Butanolkonzentration sowie die Reduktion von Nebenprodukten. Um das Bakterium durch genetische Manipulation, auch als „Metabolic Engineering“ bezeichnet, zu verändern und sukzessive einzelne Stoffwechselzweige auszuschalten, wurde das ClosTron®-System verwendet. Während dieser Arbeit konnten eine Vielzahl von Insertionsmutanten erzeugt werden. Die Inaktivierung der 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase ermöglichte den Einblick in den Gärungsstoffwechsel ohne den C4-Weg und der damit verbundenen Butyrat- und Butanolproduktion. Dennoch war dieser Stamm lebensfähig, bildete Sporen und produzierte erstaunlichen Mengen an Ethanol. Durch das Ausschalten der Phosphotransbutyrylase und bei pH-kontrolliertem Wachstum konnte das Bakterium zu einem Butyrat-negative und verstärkten Ethanol-bildenden Stamm verändert werden. Das Nebenprodukt Aceton wurde durch das Ausschalten der Acetoacetyl-CoA:Acyl-CoA-Transferase komplett eliminiert und durch das Inaktivieren der Acetoacetat-Decarboxylase drastisch reduziert. Zum ersten Mal erfolgte die Herstellung von Doppel-Integranten mit dem ClosTron®-System in C. acetobutylicum ATCC 824, wodurch ein Acetat-reduzierter und gleichzeitig Aceton-negativer Phänotyp erzielt werden konnte. Zusammenfassend lieferte die Analyse der Insertionsmutanten Einblicke in die Funktion einzelner Abschnitte des komplexen Gärungsstoffwechsels auf die Lösungsmittelproduktion in C. acetobutylicum.