Ziel der Arbeit war es die Zyklisierungsreaktion zum 1,8-Cineole in der 1,8-Cineolsynthase aus Nicotiana suaveolens zu analysieren. α-Terpineol wird als Vorläufer-Terpen der bizyklischen Verbindung 1,8-Cineol betrachtet. Die α-Terpineolsynthase aus N. langsdorfii synthetisiert fünf Monoterpene mit α-terpineol als Hauptprodukt während die 1,8-Cineolsynthase aus N. suaveolens zwar die gleichen fünf Monoterpene aber mit 1,8-Cineol als Hauptprodukt synthetisiert jedoch mit 1,8-Cineol als Hauptprodukt. Deshalb wurden die Multiproduktenzyme 1,8-Cineolsynthase aus N. suaveolens und die α-Terpineolsynthase aus N. langsdorfii miteinander verglichen. In diesem Vergleich wurden 53 Unterschiede konstatiert. Daraufhin wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine oder mehrere dieser unterschiedlichen Aminosäuren das Produktspektrum beeinflussen. Mittels site-directed mutagenesis wurden 19 Mutanten der 1,8-Cineolsynthase aus N. suaveolens generiert, indem an speziellen Positionen die Aminosäuren der 1,8-Cineolsynthase mit den entsprechenden Aminosäuren aus der α-Terpineolsynthase substituiert wurden. Der Vergleich der gaschromatographisch-massenspektrometrischen Produktprofile der Mutanten-Enzyme mit dem Wildtyp-Enzym brachte Aufschluss darüber, welche Position einen Einfluss auf die Zyklisierung zum 1,8-Cineol hat. Die Mutante F266S, in der ein Phenylalanin durch ein Serin ersetzt wurde, zeigte ein Produktspektrum, indem nun α-Terpineol als Hauptprodukt gebildet wurde und nicht mehr 1,8-Cineol. Die Generierung weiterer Mutanten (F266C, F266V, F266T, F266Y) an dieser Position verdeutlichte, dass das Vorhandensein einer freistehenden Hydroxylgruppe die Zyklisierungsreaktion entscheidend beeinflusst. Abschließend wurde ein putativer Reaktionsmechanismus für die Bildung des 1,8-Cineols vorgeschlagen.
Aim of this study was the analysis of the cyclization reaction to 1,8-cineole of the 1,8-cineole synthase of Nicotiana suaveolens. α-terpineol has been considered so far as the precursor of the bicyclic compound 1,8-cineole. The α-terpineol synthase of N. langsdorfii synthesizes five monoterpenoids with α-terpineol as the major compound whereas the 1,8-cineole synthase of N. suaveolens synthesizes the same five monoterpenoids with 1,8-cineole as major compound. Therefore these multi-product enzymes, the 1,8-cineole synthase of Nicotiana suaveolens and the α-terpineol synthase of N. langsdorfii, were aligned. This comparison revealed 53 differences. It was hypothesized that one or more of these varying amino acids influence the product spectrum. Nineteen mutants of the 1,8-cineole synthase of N. suaveolens were generated by site-directed mutagenesis in order to substitute the amino acids of the 1,8-cineole synthase with amino acids of the equivalent position of the α-terpineol synthase of N. langsdorfii. The comparison of the gas chromatographic - mass spectrometric product profiles of the mutant enzymes with the wild type enzyme revealed insights about the impact of the substituted amino acid on the cyclization reaction to 1,8-cineole. The mutant enzyme F266S carrying a phenylalanine replacement by serine showed an inverted product spectrum, showing α-terpineol as the major product. The generation of four other mutants (F266C, F266V, F266T, F266Y) at the position 266 showed that the existence of an outside hydroxyl group influences the cyclization reaction. Finally, a putative reaction mechanism for the formation of 1,8-cineole was suggested.